摘要神經(jīng)分化、iPSC衍生神經(jīng)元、神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)和神經(jīng)類器官構(gòu)建對(duì)培養(yǎng)體系穩(wěn)定性要求很高。很多實(shí)驗(yàn)在文獻(xiàn)步驟相似、細(xì)胞來源相近的情況下仍然出現(xiàn)分化效率、細(xì)胞形態(tài)、類器官大小和成熟度波動(dòng)其中一個(gè)容易被忽視的因素是培養(yǎng)基補(bǔ)充劑本身的定義程度、動(dòng)物源風(fēng)險(xiǎn)和批次一致性。HiDef N-2是Defined Bioscience開發(fā)的無動(dòng)物源、成分明確N-2添加劑用于支持神經(jīng)元、神經(jīng)祖細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞以及PSC向神經(jīng)譜系分化。本文圍繞N-2添加劑在神經(jīng)培養(yǎng)體系中的作用、HiDef N-2的配方邏輯、Defined培養(yǎng)體系與NAMs趨勢(shì)的關(guān)系以及HiDef B8、Ready-CEPT、HiDef ITS和Qkine神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在標(biāo)準(zhǔn)化神經(jīng)培養(yǎng)工作流中的銜接進(jìn)行解析。關(guān)鍵詞N-2添加劑、HiDef N-2、神經(jīng)分化、iPSC分化、iPSC、神經(jīng)類器官、神經(jīng)培養(yǎng)、無動(dòng)物源、化學(xué)成分限定、Defined培養(yǎng)體系、NAMs、Qkine、Defined Bioscience神經(jīng)分化實(shí)驗(yàn)為什么容易出現(xiàn)重復(fù)性問題神經(jīng)分化實(shí)驗(yàn)看起來有明確流程但真實(shí)操作中經(jīng)常出現(xiàn)難以解釋的波動(dòng)。同樣的iPSC細(xì)胞系、同樣參考文獻(xiàn)、同樣誘導(dǎo)步驟不同實(shí)驗(yàn)室之間可能得到不同結(jié)果同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室在不同時(shí)間重復(fù)實(shí)驗(yàn)也可能出現(xiàn)神經(jīng)元比例、細(xì)胞形態(tài)、神經(jīng)突起生長(zhǎng)、類器官大小和成熟度不一致的問題。當(dāng)實(shí)驗(yàn)失敗時(shí)研究者通常會(huì)優(yōu)先檢查細(xì)胞狀態(tài)、傳代次數(shù)、誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)、生長(zhǎng)因子活性、操作手法和培養(yǎng)箱條件但培養(yǎng)體系本身的組成和批次穩(wěn)定性同樣會(huì)影響結(jié)果。神經(jīng)培養(yǎng)體系往往對(duì)微小變量非常敏感。iPSC向神經(jīng)譜系分化時(shí)細(xì)胞需要在多能性退出、神經(jīng)外胚層誘導(dǎo)、神經(jīng)祖細(xì)胞擴(kuò)增、神經(jīng)元成熟或膠質(zhì)細(xì)胞分化等階段逐步轉(zhuǎn)換。不同階段對(duì)營(yíng)養(yǎng)、微量元素、激素類成分、抗氧化組分和生長(zhǎng)因子刺激都有不同需求。如果培養(yǎng)基補(bǔ)充劑中存在未定義組分、動(dòng)物源成分或批次差異就可能改變細(xì)胞命運(yùn)選擇和成熟速度進(jìn)而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)重復(fù)性下降。這也是為什么Defined培養(yǎng)體系在iPSC衍生模型和神經(jīng)類器官研究中越來越受關(guān)注。所謂Defined并不只是“沒有血清”這么簡(jiǎn)單而是強(qiáng)調(diào)配方成分明確、來源可追溯、批次間差異盡量降低并且能夠支持標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)流程。對(duì)于希望建立疾病模型、藥物篩選模型、神經(jīng)類器官或器官芯片模型的研究團(tuán)隊(duì)來說培養(yǎng)體系越可控后續(xù)數(shù)據(jù)解釋、跨批次比較和平臺(tái)化復(fù)現(xiàn)就越容易。Qkine與Defined Bioscience相關(guān)產(chǎn)品資料可參考Qkine生物活性蛋白與Defined培養(yǎng)體系資料頁(yè)面。N-2為什么是神經(jīng)培養(yǎng)體系中的基礎(chǔ)添加劑N-2添加劑來源于Bottenstein經(jīng)典無血清神經(jīng)培養(yǎng)配方是神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)體系中非常重要的基礎(chǔ)補(bǔ)充劑之一。N-2的設(shè)計(jì)初衷是在無血清條件下支持神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)同時(shí)減少血清帶來的未知因子干擾。相比含血清體系N-2配方更精簡(jiǎn)成分更明確可用于原代神經(jīng)元、神經(jīng)細(xì)胞系、iPSC衍生神經(jīng)元、神經(jīng)干細(xì)胞分化以及神經(jīng)器官芯片、血腦屏障模型和神經(jīng)類器官等體系。N-2在神經(jīng)培養(yǎng)中的價(jià)值主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面。第一它提供神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)所需的關(guān)鍵基礎(chǔ)成分包括營(yíng)養(yǎng)支持、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)、抗氧化保護(hù)、細(xì)胞生長(zhǎng)支持和神經(jīng)分化相關(guān)刺激。第二它有助于減少血清體系中的非目標(biāo)影響例如血清可能促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖導(dǎo)致神經(jīng)元富集效果下降或給不同批次實(shí)驗(yàn)帶來背景差異。因此在神經(jīng)分化和神經(jīng)元培養(yǎng)體系中N-2長(zhǎng)期被視為核心添加劑之一。不過隨著神經(jīng)模型從傳統(tǒng)二維培養(yǎng)走向iPSC衍生神經(jīng)元、神經(jīng)類器官、微生理系統(tǒng)和器官芯片研究者對(duì)N-2的要求也在提高。過去只要“能支持細(xì)胞培養(yǎng)”就足夠現(xiàn)在更關(guān)注配方是否完全定義、是否無動(dòng)物來源、是否具有可追溯性、是否經(jīng)過PSC相關(guān)模型驗(yàn)證以及是否適用于更復(fù)雜的人源體外模型。HiDef N-2正是在這一背景下被用于神經(jīng)培養(yǎng)體系標(biāo)準(zhǔn)化。HiDef N-2的配方組成與應(yīng)用定位Defined Bioscience的HiDef N-2是一種成分明確的神經(jīng)培養(yǎng)基補(bǔ)充劑設(shè)計(jì)用于培養(yǎng)和生長(zhǎng)神經(jīng)元、神經(jīng)祖細(xì)胞、干細(xì)胞和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞類型也可用于誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向神經(jīng)及胰腺譜系分化。對(duì)于神經(jīng)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)來說它的核心定位不是單一營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充而是幫助建立更可控、更穩(wěn)定、更少動(dòng)物源風(fēng)險(xiǎn)的Defined神經(jīng)培養(yǎng)體系。圖1.HiDef N-2神經(jīng)培養(yǎng)基補(bǔ)充劑HiDef N-2由胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉、腐胺和孕酮等成分組成。胰島素可參與葡萄糖攝取和細(xì)胞代謝支持轉(zhuǎn)鐵蛋白用于促進(jìn)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)亞硒酸鈉作為常用培養(yǎng)基成分和抗氧化相關(guān)組分腐胺參與支持細(xì)胞生長(zhǎng)孕酮?jiǎng)t與生長(zhǎng)、神經(jīng)元分化和刺激相關(guān)。這樣的配方邏輯延續(xù)了N-2在無血清神經(jīng)培養(yǎng)中的基礎(chǔ)作用同時(shí)通過明確成分和無動(dòng)物源設(shè)計(jì)提高其在iPSC和神經(jīng)類器官體系中的適配性。對(duì)于iPSC神經(jīng)分化研究而言HiDef N-2可用于多能干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化、神經(jīng)類器官生長(zhǎng)與分化、神經(jīng)干細(xì)胞研究和神經(jīng)細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)等方向。與傳統(tǒng)不完全定義體系相比Defined N-2添加劑能夠降低未知成分帶來的實(shí)驗(yàn)噪音讓研究者更容易判斷分化效果變化究竟來自細(xì)胞狀態(tài)、誘導(dǎo)因子、時(shí)間窗口還是培養(yǎng)體系本身。Defined培養(yǎng)體系與NAMs模型標(biāo)準(zhǔn)化的關(guān)系近年來新方法學(xué)模型也就是New Approach MethodologiesNAMs在藥物研發(fā)、毒理學(xué)評(píng)價(jià)和疾病建模中持續(xù)受到關(guān)注。類器官、器官芯片、微生理系統(tǒng)和iPSC衍生模型都屬于人體相關(guān)性更強(qiáng)的體外模型方向。對(duì)于這些模型來說僅僅構(gòu)建出“看起來像”的細(xì)胞結(jié)構(gòu)并不夠模型還需要具備良好的生物學(xué)相關(guān)性、技術(shù)表征和實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。在這一趨勢(shì)下培養(yǎng)體系的重要性被進(jìn)一步放大。iPSC神經(jīng)元、神經(jīng)類器官和神經(jīng)器官芯片模型如果使用未定義或批次差異較大的培養(yǎng)體系即使模型形態(tài)接近也可能難以解釋批次間功能差異。反過來若培養(yǎng)基補(bǔ)充劑具有成分明確、無動(dòng)物源、批次一致性較高等特點(diǎn)就更有利于建立可重復(fù)、可表征、可遷移的人源神經(jīng)模型。HiDef N-2所強(qiáng)調(diào)的Fully Defined、Animal Origin Free和Batch Consistency并不只是產(chǎn)品標(biāo)簽而是對(duì)應(yīng)神經(jīng)培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化需求的幾個(gè)關(guān)鍵維度。Fully Defined有助于提高實(shí)驗(yàn)可解釋性Animal Origin Free有助于降低動(dòng)物源成分帶來的不確定性和潛在風(fēng)險(xiǎn)Batch Consistency則有助于降低重復(fù)實(shí)驗(yàn)和長(zhǎng)期項(xiàng)目中的批次波動(dòng)。對(duì)于神經(jīng)分化、神經(jīng)類器官、血腦屏障模型和器官芯片研究來說這些特點(diǎn)都可以轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的數(shù)據(jù)質(zhì)量。HiDef N-2不是孤立添加劑而是Defined神經(jīng)培養(yǎng)工作流的一環(huán)神經(jīng)分化實(shí)驗(yàn)往往不是從N-2開始也不會(huì)止步于N-2。一個(gè)完整的iPSC神經(jīng)培養(yǎng)流程通常包含多能干細(xì)胞維持、傳代和凍融恢復(fù)、神經(jīng)誘導(dǎo)、神經(jīng)祖細(xì)胞擴(kuò)增、神經(jīng)元成熟、膠質(zhì)細(xì)胞分化以及類器官長(zhǎng)期培養(yǎng)等多個(gè)階段。因此N-2添加劑的價(jià)值需要放入完整Defined Workflow中理解。Defined Bioscience體系中HiDef B8可用于人類多能干細(xì)胞在未分化狀態(tài)下的維持和擴(kuò)增為后續(xù)神經(jīng)分化提供穩(wěn)定起始細(xì)胞。Ready-CEPT可用于改善干細(xì)胞在常規(guī)傳代、冷凍保存和凍融恢復(fù)過程中的存活率和生長(zhǎng)率有助于減少分化實(shí)驗(yàn)起點(diǎn)差異。HiDef ITS則可在低血清條件下支持低密度貼附細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)。Qkine神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子體系則覆蓋神經(jīng)誘導(dǎo)和維持、神經(jīng)分化和成熟、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化和成熟等多個(gè)應(yīng)用方向。圖2.HiDefB8干細(xì)胞培養(yǎng)基圖3.Ready-CEPT細(xì)胞活力補(bǔ)充劑圖4.HiDef ITS細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)充劑圖5.維持和分化神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)因子這種工作流思路的意義在于把神經(jīng)培養(yǎng)中的多個(gè)易波動(dòng)環(huán)節(jié)盡量標(biāo)準(zhǔn)化。多能干細(xì)胞維持不穩(wěn)定會(huì)影響分化起點(diǎn)凍融恢復(fù)狀態(tài)不一致會(huì)影響細(xì)胞群體均一性神經(jīng)誘導(dǎo)和成熟階段補(bǔ)充劑不穩(wěn)定會(huì)影響終點(diǎn)表型和功能。將HiDef N-2與Defined Bioscience培養(yǎng)基補(bǔ)充劑和Qkine神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子組合使用有助于建立從干細(xì)胞維持到神經(jīng)成熟的連續(xù)、可追蹤培養(yǎng)體系。從“培養(yǎng)成功”到“可重復(fù)、可驗(yàn)證的人源神經(jīng)模型”很多神經(jīng)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)正在發(fā)生變化。過去研究者更關(guān)心“能不能分化出神經(jīng)元”現(xiàn)在越來越多團(tuán)隊(duì)關(guān)注“能否穩(wěn)定分化出相同質(zhì)量的神經(jīng)元或類器官”。這種變化來自兩個(gè)方向一方面iPSC疾病模型、神經(jīng)類器官和器官芯片需要更高重復(fù)性才能用于機(jī)制研究和藥物篩選另一方面NAMs相關(guān)體外模型若要進(jìn)入更規(guī)范的評(píng)價(jià)體系也需要明確技術(shù)表征和數(shù)據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。圖6.Qkine與Defined Bioscience在這個(gè)背景下HiDef N-2代表的不只是N-2添加劑本身而是Defined培養(yǎng)體系在神經(jīng)模型標(biāo)準(zhǔn)化中的應(yīng)用方向。對(duì)于研究者而言建立更穩(wěn)定的神經(jīng)培養(yǎng)體系可以從幾個(gè)層面入手首先使用狀態(tài)穩(wěn)定、質(zhì)量可控的iPSC作為起始材料其次在PSC維持、傳代、神經(jīng)誘導(dǎo)和成熟階段盡量減少動(dòng)物源和未定義成分再次記錄補(bǔ)充劑批號(hào)、使用濃度、培養(yǎng)時(shí)間和關(guān)鍵形態(tài)學(xué)/分子讀數(shù)最后用標(biāo)準(zhǔn)化表征指標(biāo)評(píng)價(jià)模型是否達(dá)到預(yù)期而不是僅憑單次形態(tài)觀察判斷實(shí)驗(yàn)成功。小結(jié)神經(jīng)分化和神經(jīng)類器官培養(yǎng)的不穩(wěn)定往往來自多因素疊加。細(xì)胞狀態(tài)、誘導(dǎo)方案、操作時(shí)間點(diǎn)、生長(zhǎng)因子活性和培養(yǎng)條件都重要但培養(yǎng)基補(bǔ)充劑的定義程度、動(dòng)物源風(fēng)險(xiǎn)和批次一致性同樣不應(yīng)被忽視。N-2作為經(jīng)典無血清神經(jīng)培養(yǎng)添加劑在原代神經(jīng)元、iPSC衍生神經(jīng)元、神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)類器官研究中具有基礎(chǔ)價(jià)值。HiDef N-2在傳統(tǒng)N-2配方邏輯基礎(chǔ)上進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)Fully Defined、Animal Origin Free和Batch Consistency為構(gòu)建更標(biāo)準(zhǔn)化的人源神經(jīng)模型提供了一個(gè)重要培養(yǎng)變量。對(duì)于iPSC神經(jīng)分化、神經(jīng)類器官、血腦屏障模型和器官芯片研究而言未來的優(yōu)化方向不是只追求“某一次實(shí)驗(yàn)成功”而是建立可重復(fù)、可表征、可遷移的Defined Workflow。HiDef N-2與HiDef B8、Ready-CEPT、HiDef ITS以及Qkine神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等體系結(jié)合可用于從多能干細(xì)胞維持到神經(jīng)成熟的完整流程設(shè)計(jì)。實(shí)際應(yīng)用時(shí)仍需結(jié)合具體細(xì)胞系、分化方案、誘導(dǎo)因子組合和終點(diǎn)檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。FAQ常見問題及解答1. N-2添加劑在神經(jīng)培養(yǎng)中主要起什么作用N-2是經(jīng)典無血清神經(jīng)培養(yǎng)添加劑通常用于支持神經(jīng)元、神經(jīng)祖細(xì)胞、iPSC衍生神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)類器官培養(yǎng)。其作用包括提供代謝支持、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)、抗氧化保護(hù)和神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)成分同時(shí)減少血清中未知因子對(duì)神經(jīng)培養(yǎng)體系的干擾。2. HiDef N-2與傳統(tǒng)N-2相比重點(diǎn)差異是什么HiDef N-2強(qiáng)調(diào)成分明確、無動(dòng)物來源和批次一致性適合希望建立標(biāo)準(zhǔn)化神經(jīng)分化和神經(jīng)類器官培養(yǎng)體系的研究。它不僅用于常規(guī)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)也可用于多能干細(xì)胞向神經(jīng)譜系分化以及神經(jīng)類器官相關(guān)流程。3. 為什么iPSC神經(jīng)分化越來越關(guān)注Defined培養(yǎng)體系iPSC神經(jīng)分化對(duì)培養(yǎng)條件高度敏感未定義成分和批次差異會(huì)影響分化效率、細(xì)胞形態(tài)、類器官大小和成熟度。Defined體系有助于降低未知變量提高實(shí)驗(yàn)重復(fù)性也更符合人源模型和NAMs方法學(xué)對(duì)模型表征與可重復(fù)性的要求。4. HiDef N-2能否單獨(dú)解決所有神經(jīng)分化波動(dòng)不能。HiDef N-2可以降低培養(yǎng)補(bǔ)充劑層面的不確定性但神經(jīng)分化結(jié)果仍受iPSC狀態(tài)、傳代次數(shù)、誘導(dǎo)因子、接種密度、培養(yǎng)時(shí)間、基質(zhì)和操作流程影響。更合理的做法是將HiDef N-2納入完整Defined Workflow并系統(tǒng)記錄和驗(yàn)證關(guān)鍵變量。延伸閱讀Qkine生物活性蛋白與Defined培養(yǎng)體系資料頁(yè)面iPSCs分化為多巴胺能神經(jīng)元實(shí)驗(yàn)方案iPSCs分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方案關(guān)于技術(shù)來源本文基于Qkine及Defined Bioscience公開資料曼博生物整理用于科研信息分享、實(shí)驗(yàn)參考和神經(jīng)培養(yǎng)Defined體系搭建思路參考。HiDef N-2在神經(jīng)培養(yǎng)中的應(yīng)用涉及iPSC細(xì)胞狀態(tài)、神經(jīng)分化方案、N-2添加劑組成、神經(jīng)元或神經(jīng)祖細(xì)胞培養(yǎng)、神經(jīng)類器官生長(zhǎng)與分化、無動(dòng)物源體系、批次一致性、HiDef B8、Ready-CEPT、HiDef ITS和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子組合等多項(xiàng)變量實(shí)際應(yīng)用前仍需結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行驗(yàn)證。本文圍繞Qkine、Defined Bioscience HiDef N-2、N-2神經(jīng)培養(yǎng)基補(bǔ)充劑、iPSC神經(jīng)分化、神經(jīng)類器官、NAMs模型、無動(dòng)物源培養(yǎng)體系和Defined Workflow等方向提供產(chǎn)品信息與技術(shù)資料支持。本文不作為臨床應(yīng)用建議僅供科研與實(shí)驗(yàn)流程參考。